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公司新聞

醫(yī)院檢驗科病毒核酸檢測設備與要求


PCR實驗室的基本設備與要求


一、?臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設置原則

（一）?臨床基因擴增檢驗實驗室區(qū)域設置原則

1、?試劑儲存和準備區(qū)
2、?標本制備區(qū)
3、?擴增反應混合物配制和擴增區(qū)
4、?擴增產(chǎn)物分析區(qū)?如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當合并。

（二）?各工作區(qū)域必須有明確的標記，避免不同工作區(qū)域內(nèi)的設備、物品混用。

（三）?進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行?即試劑儲存和準備區(qū)?—>標本制備區(qū)—>擴增反應混合物配制和擴增區(qū)—>擴增產(chǎn)物分析區(qū)。

（四）?不同的工作區(qū)域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出。


二、?工作區(qū)域儀器設備配置標準


（一）?試劑儲存和準備區(qū)
1、2-8度和-15度冰箱
2、混勻器
3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
4、移動紫外燈（近工作臺面）
5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
6、用工作服和工作鞋
7、用辦公用品

（二）?標本制備區(qū)
1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱
2、高速臺式冷凍離心機
3、混允器
4、福意聯(lián)樣本滅活恒溫箱 
5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul）?? 
6、可移動紫外燈（近工作臺面）
7、超凈工作臺
8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
9、用工作服和工作鞋
10、用辦公用品?，如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。

（三）?擴增反應混合物配制和擴增區(qū)
1、?核酸擴增儀
2、?微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
3、?可移動紫外燈（近工作臺面）
4、?消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心）
5、?用工作服和工作鞋
6、?用辦公用品
(四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)?視檢驗方法不同而定，基本儀器設備如下：
1、?微量加樣器（覆蓋1-1000ul）
2、?可移動紫外燈（近工作臺面）
3、?消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心）
4、?用工作服和工作鞋
5、?用辦公用品


臨床基因擴增檢驗實驗室的規(guī)范化設置及其管理

(一)試劑貯存和準備區(qū)

   下述操作在該區(qū)進行：貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。?貯存試劑和用于標本制備的材料應直接運送至試劑貯存和準備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。在打開含有反應混合液的離心管或試管前，應將其快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成需的貯存試劑。當貯存試劑溶液經(jīng)檢查可用后，應將其分裝貯存?zhèn)溆茫苊庥捎诮?jīng)常打開反應管吸液而造成污染。

     含反應混合液的離心管或試管在冰凍前都應快速離心數(shù)秒。大多數(shù)用于擴增的試劑都應冰凍貯存。為避免因單次反應取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應分裝冰凍貯存試劑溶液。貯存試劑的分裝體積根據(jù)通常在實驗室內(nèi)一次測定需的擴增反應數(shù)來決定。

     主反應混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性預試驗來檢查，評價結(jié)果必須有書面報告。對于"熱啟動"技術(在**個高溫變性步驟后加入酶)，聚合酶也可不包含在主反應混合液中。

    在整個本區(qū)的實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施。

    嚴禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。?工作結(jié)束后必須立即對工作區(qū)進行清潔。本工作區(qū)的實驗臺表面應可耐受諸如次氯酸鈉的化學物質(zhì)的**清潔。實驗臺表面的紫外照射應方便有效。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實驗臺上60~90cm內(nèi)照射。由于擴增產(chǎn)物僅幾百bp，對紫外線損傷不敏感，因此紫外照射擴增片段必須延長照射時間，*好是照射過夜。實驗室及其設備的使用必須有日常記錄。

(二)標本制備區(qū)

   下述操作在該區(qū)進行：臨床標本的保存，核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。?要正確使用加樣器。由于在加樣操作中可能會發(fā)生氣溶膠致的污染，以應避免在本區(qū)內(nèi)不必要的走動?？稍诒緟^(qū)內(nèi)設立正壓條件避免從鄰近區(qū)進入本區(qū)的氣溶膠污染。為避免樣本間的交叉污染，加入待測核酸后，必須蓋好含反應混合液的反應管。對具有潛在傳染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序。

    用過的加樣器吸頭必須放入門的**(例如含次氯酸鈉溶液)容器內(nèi)。實驗室桌椅表面每次工作后都要清潔，實驗材料(原始血標本、標本、提取中的標本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。

    對實驗臺適當?shù)淖贤庹丈?254nm波長，與工作臺面近距離)適合于滅活去污染?？梢苿幼贤饩€管燈可用來確保工作后對實驗臺面的充分照射。?樣本處理對PCR實驗室要求和基本設備核酸擴增有很大影響，必須使用有效的核酸提取方法，可在開展臨床標本檢測前對提取方法進行評價。

    用于RNA擴增檢測的樣本制備好以后，應立即進行cDNA合成，因為cDNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。為保逆轉(zhuǎn)錄反應的需要，應在標本制備區(qū)設置一個以上的溫育裝置。

   cDNA合成的理想溫度依使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴增反應緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進行擴增發(fā)生污染的可能性降低。

   待測RNA的cDNA拷貝須保存在標本制備區(qū)，不得在本區(qū)對樣本進行PCR擴增。

（三)擴增區(qū)

  下述工作在本區(qū)內(nèi)進行：DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進行。在巢式PCR測定中，通常在**輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，**次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進行。?不能從本區(qū)再進入任何"上游"區(qū)域，可降低本區(qū)的氣壓以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。?為避免氣溶膠致的污染，應盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。如有加樣則應在超凈臺內(nèi)進行。打開預處理過的反應混合液時必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴增步驟之間。一個簡單的方法是在打開反應管前快速離心數(shù)秒?？墒褂皿w積較小的離心機，因其占實驗臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。防潮屏障如石蠟油或輕礦物油也具有防污染，但必須注意的是，礦物油本身也可能成為一種持續(xù)性的污染源。用過的加樣器必須注意清潔**。

   完成操作及每天工作后都必須對實驗室臺面進行清潔和**，紫外照射方法與前面區(qū)域相同。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。

  (四)擴增產(chǎn)物分析區(qū)???下述操作在本區(qū)內(nèi)進行：擴增片段的測定。

  核酸擴增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標記或非同位素標記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern  轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。目前國內(nèi)的商品試劑盒絕大部分均采用非同位素標記的微孔板上探針雜交方法，即PCR-ELISA方法，也有膜上探針雜交方法。?本區(qū)是*主要的擴增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免本區(qū)的物品及工作服將擴增產(chǎn)物帶出。在使用PCR-ELISA方法檢測擴增產(chǎn)物時，必須使用洗板機洗板，廢液必須收集至1mol/L?HC1中，并且不能在實驗室內(nèi)傾倒，而應至遠離PCR實驗室的地方棄掉。用過的吸頭也必須放至1mol/L?HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。?由于本區(qū)有可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)如溴化乙錠、丙烯酰胺、甲醛或同位素等，故應注意實驗人員的防護。